עריכת הגנום בטכנולוגית CRISPR

טכנולוגיית CRISPR מאפשרת לחוקרים לערוך גנום באמצעות שינויים ברצפי הדנ"א המובילים לשינוי תפקודו של הגן. לטכנולוגיה יישומים רבים, לרבות תיקון פגמים גנטיים, טיפול במחלות ומניעת התפשטותן ושיפור יבולים חקלאיים.

כלי עריכת גנום, כגון טכנולוגיית CRISPR-Cas9, ניתנים להנדוס בכדי לבצע שינויים מדויקים בכרומוזום המטרה שבו ממוקם גן או מרכיב פונקציונלי מסוים. ואולם, עריכה באמצעות CRISPR חשופה לסיבוך פוטנציאלי העלול להוביל לשינוי גנומי אחר ובלתי מתוכנן. שינויים אלה קרויים פעילות off-target (שסטתה מהמטרה). כשעורכים מספר אתרים שונים בגנום, פעילות off target עלולה להוביל לשינויי מיקום (טרנסלוקציות), סידור יוצא דופן של כרומוזומים או לשינויים גנומיים בלתי-מתוכננים אחרים.

לפיכך, בקרת פעילות העריכה הסוטה מהמטרה היא אחד האתגרים המרכזיים בשיפור הדיוק של טכנולוגיית CRISPR-Cas9 לצורך יישומה בפרקטיקה הרפואית. שיטות המדידה הקיימות, כגון דגימות וניתוח נתונים לכימות הפעילות שסטתה מהמטרה אינן מספקות הערכה סטטיסטית ולפיכך אינן רגישות דיין כדי לבודד את האותות מהרעש בניסויים של שיעורי עריכה נמוכים. בנוסף, השימוש בהן מסורבל ומצריך מאמצים ניכרים באיתור הטרנסלוקציות שחלו.

צוות חוקרים רב-תחומי מאוניברסיטת בר-אילן ומהמרכז הבינתחומי הרצליה דיווח בכתב העת המדעי Nature Communication על פיתוח כלי תכנה חדש המאתר, בודק ומודד את פעילות העריכה שסטתה מהמטרה, לרבות אירועי טרנסלוקציה שליליים שחלו בעקבות כך ועלולים לגרום לסרטן. התוכנה מבוססת על תשומה המופקת מתבחין (assay) סטנדרטי והיא מבצעת multiplexed PCR amplification וריצוף של הדור הבא (NGS).

כלי התוכנה, המוכר בשם CRISPECTOR, מנתח נתוני NGS המופקים מניסויים ב-CRISPR Cas9 ומיישם מידול סטטיסטי כדי לקבוע ולכמת את פעילות העריכה. CRISPECTOR מודד במדויק את פעילות ה-off-target בכל מיקום שנחקר. בנוסף, הוא משפר את שיעור התשובות השליליות שגויות (false negatives) באתרים שפעילות ה-off-target בהם חלשה אך משמעותית. אחד המאפיינים החדשניים של CRISPECTOR הוא יכולתו לאתר אירועי טרנסלוקציה שליליים המתרחשים במהלך ניסוי עריכה.

"עריכה גנטית, במיוחד ביישומים קליניים, מחייבת זיהוי רמות נמוכות של פעילות off-target ואירועי טרנסלוקציה שליליים. אפילו מספר קטן של תאים עם פוטנציאל מסרטן המושתלים במטופל בהקשר של טיפול גנטי, עלול להוביל להשלכות שליליות מבחינת התפתחות הפתולוגיה הסרטנית. לכן חשוב לאתר את האירועים הפוטנציאליים האלה מראש כחלק מהפרוטוקולים הטיפוליים," אמר ד"ר אייל הנדל מהפקולטה למדעי החיים ע"ש מינה ואבררד גודמן באוניברסיטת בר-אילן.

לכל המידע על לימודי ביולוגיה חישובית בבר-אילן>>>

ד"ר הנדל הוביל את המחקר יחד עם פרופ' זהר יכיני מבית הספר למדעי המחשב ע"ש ארזי במרכז הבינתחומי הרצליה. "CRISPECTOR מספק שיטה אפקטיבית לאיפיון וכימות שגיאות פוטנציאליות הנגרמות על-ידי CRISPR ובכך משפר מהותית את בטיחות השימוש הקליני בעריכת גנום." הצוות של הנדל השתמש בטכנולוגיית CRISPR-Cas9 כדי לערוך גנים בתאי גזע רלוונטיים להפרעות בדם ובמערכת החיסונית. ניתוח הנתונים המחיש לחברי הצוות את חסרונותיהם של הכלים הקיימים לכימות פעילות off-target ולפערים שעליהם יש לגשר כדי לשפר את יכולת היישום של הטכנולוגיה. ניסוי זה הוביל לשיתוף הפעולה עם קבוצת הביולוגיה המיחשובית והביו-אינפורמטיקה של פרופ' יכיני.

פרופ' זהר יכיני מהמרכז הבינתחומי הרצליה והטכניון, הוסיף "בניסויים העושים שימוש בטכניקות ריצוף עמוקות עם רמות משמעותיות של רעשי רקע, רמות נמוכות של פעילות off-target עלולות ללכת לאיבוד בתוך הרעש. הצורך בגישת מדידה ובניתוח נתונים המסוגלים לראות מעבר לרעש ולאתר אירועי טרנסלוקציה שליליים המתרחשים בניסוי העריכה הנו ברור למדענים ולאנשים המבצעים את עריכת הגנום.

CRISPECTOR הוא כלי המסוגל לחפש בתוך רעשי הרקע כדי לזהות ולכמת אותות אמיתיים המעידים על פעילות off-target. בנוסף, הודות לשימוש במידול סטטיסטי וניתוח נתונים קפדני, ה-CRISPECTOR מסוגל גם לזהות קשת רחבה יותר של סטיות גנומיות. איפיון וכימות של שגיאות פוטנציאליות הנגרמות על-ידי CRISPR יאפשרו לשיטות שלנו להבטיח שימוש קליני בטוח יותר בגישות תרפויטיות של עריכת גנום."

מעבדת הנדל וקבוצת המחקר של יכיני מתכוונות ליישם את הכלי במחקר טיפולים פוטנציאליים בהפרעות גנטיות של המערכת החיסונית וגישות אימונותרפיה בסרטן. המחקר הוא שיתוף פעולה בין מעבדת הנדל באוניברסיטת בר-אילן וקבוצת המחקר יכיני (המרכז הבינתחומי הרצליה והטכניון). את הפרויקט הובילו עידו עמית (המרכז הבינתחומי) ואורטל ינקו (בר-אילן); עוד השתתפו במחקר דניאל אלן, דור ברייר, ונמרוד בן-חיים (בר-אילן); אלונה לוי-יורגנסון (טכניון; ליאון ענבי (הטכניון והבינתחומי); גווין קורגן, מת'יו ס. מקניל, גארט ר. רטיג ויו וונג (Integrated DNA Technologies, (IDT INC, ארה"ב. עוד סייעו במחקר צ'יהונג צ'וי (הבינתחומי) ומארק בילקה (IDT, ארה"ב).

המחקר נערך בסיוע מענק ממועצת המחקר האירופי (ERC) כחלק מתכנית Horizon 2020 למחקר וחדשנות ותכנית אדאמס של האקדמיה הישראלית למדעים ומדעי הרוח.